殊异韦荣菌苹果酸脱氢酶基因的克隆及其重组蛋白的表达，纯化和活性测定

【摘要】殊异韦荣菌（Veillonelladispar）是口腔中一种常见的革兰阴性厌氧小球菌，是较早定植于牙菌斑中的常驻菌。苹果酸脱氢酶（Malatedehydrogenase，MDH）在殊异韦荣菌代谢产酸的过程中起到调节作用，对龋病的发生和发展起着重要的作用。在这个实验中，以殊异韦荣菌为研究对象，对它的苹果酸脱氢酶基因进行克隆及重组表达，并对其重组蛋白进行纯化及活性测定，为苹果酸脱氢酶在龋病诊断和治疗中的作用奠定基础。在本实验的第一部分中，提取殊异韦荣菌基因组DNA，并通过PCR聚合酶链式反应扩增MDH基因序列，将PCR产物和pET-28a-c(+)载体进行EcoRⅠ、SalⅠ双酶切，并用T4DNA连接酶将其连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切和PCR鉴定，并进行测序验证。PCR扩增产物特异，全长1139bp。测序结果经BLAST软件分析，包含MDH基因及其前后片段，通过基因序列和氨基酸分析证明其具有完整的阅读框架，该基因序列已经登陆GenBank，序列号为KC421072。在本实验第二部分中，将鉴定正确的重组质粒MDH-pET-28a-c(+)转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行重组表达，并对其表达条件进行优化。重组质粒MDH-pET-28a-c(+)成功的在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，其表达的重组蛋白大约为36kb。经过设置不同诱导剂浓度梯度、相同诱导时间以及不同诱导时间梯度、相同诱导剂浓度成功的得出重组质粒MDH-pET-28a-c(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中的最佳诱导表达条件为IPTG终浓度为0.5mmol/L,37℃诱导6h，并经过超声破菌鉴定其表达形式为可溶性蛋白。最后对重组蛋白进行高效表达，并对其进行纯化和活性测定，其活性测定值为0.4403U/ml。本实验成功克隆出殊异韦荣菌苹果酸脱氢酶基因MDH并通过基因序列和氨基酸分析证明其具有完整的阅读框架。获得了重组表达MDH蛋白的最佳表达条件，并测出了苹果酸脱氢酶的活性，这为进一步研究苹果酸脱氢酶提供了条件，为研究苹果酸脱氢酶在龋病的诊断和治疗中的作用奠定了基础。
【作者】刘晓红；
【导师】高心；
【作者基本信息】吉林大学，口腔临床医学，2014，硕士
【关键词】韦荣菌；苹果酸脱氢酶；基因克隆；重组表达；活性测定；

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